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白木香TFs表达在连续3代盐胁迫中的变化规律研究结果分析齿轮轴

发布时间:2020-03-27 11:57:20 来源:亚动机械网

06-03

摘要:目的研究3代白木香Aquilaria sinensis离体根在盐胁迫条件下的转录因子表达模式差异,对响应盐胁迫的各代转录因子家族差异基因的变化规律进行分析。方法以组织培养的白木香离体根为材料,采用Illumina Hiseq4000双端PE150测序方法,将所有白木香Unigene序列与植物转录因子数据库(PlantTFDB)进行比对,对盐胁迫组与对照组间的3代差异转录因子进行重点分析。

结果3代白木香离体根转录组测序片段经de novo拼接共获得48 286条Unigene序列,含有1 156个潜在的白木香转录因子,分布于54个转录因子家族。其中bHLH、ERF、NAC家族是富集最多的3个家族。在第1、2、3代盐胁迫白木香根中分别筛选出290、277、349个差异表达转录因子,NAC、MYB以及WRKY家族上调表达的差异表达基因(DEG)数量随胁迫代数增加而增多,而GRAS家族上调表达的DEG数量随胁迫代数增加而减少。3代共有的差异转录因子有70个,其中8个基因的下调表达倍数随盐胁迫代数增加而递增。结论盐胁迫对白木香转录因子表达影响主要以下调为主。

盐胁迫组与对照组的差异转录因子数量随着盐胁迫代数增加而增加。不同转录因子家族基因受盐胁迫诱导表达情况不同,一些基因可能参与了胁迫记忆的传递。该研究有助于在整体水平加深了解白木香转录因子表达特性,为进一步研究白木香胁迫记忆及白木香盐胁迫响应分子机制提供参考。

植物由于固着于地面的生长模式,在生命过程中不可避免地会遭受各种各样的胁迫。一些植物在胁迫下所受刺激产生的响应能够跨代遗传,对子代产生影响,这种特性被称为植物的“胁迫记忆(stressful memories)”[1]。植物当代受到的胁迫能够影响自身后续生长以及子代对胁迫的反应,具有胁迫记忆的植物当再次遭受相同胁迫时,可快速、积极地响应胁迫,提高对胁迫的抗耐性[2]。由于地质因素及植物固着的生长模式,植物生活环境中土壤成分造成的盐胁迫往往是长期的,几乎不随时间而变化,研究多代盐胁迫对植物生长胁迫记忆的影响有重要意义。植物的胁迫记忆现象在植物胁迫机制研究、抗逆性改造、新品种培育以及植物药效成分诱导等方面均有很大的研究价值,连续多代胁迫是研究胁迫记忆的重要途径之一。

转录因子(transcription factors,TFs)也称为反式作用因子,是一类能够与真核基因启动子区域DNA相互作用,从而激活或抑制下游被调控基因转录的DNA结合蛋白[3],在调控植物生长发育和胁迫应答中起重要作用。近年来,相继从高等植物分离出一系列调控逆境胁迫等相关基因表达的TFs,DREB/ERF、MYB、NAC、bZIP和WRKY等TFs家族在植物逆境基因调控与提高植物对非生物和生物胁迫耐受性方面作用的研究多有进展[4-6]。徐鹏等[7]提出TFs的丰度可作为胁迫记忆中表观遗传信息跨代传递的载体。Conrath等[8]认为植物在遭受胁迫后可能会积累TFs,从而促进防御基因的转录。

白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属Aquilaria L.常绿乔木,其含树脂心材为传统名贵中药沉香。白木香树体只有在受到损伤、虫咬或腐朽等伤害后才能结香,对白木香进行一定胁迫处理可诱导结香成分[9],因此有研究者认为白木香结香与胁迫防御反应相关[10]。20世纪70年代以来,由于沉香被大量采集,白木香野生林遭到严重破坏,资源紧缺。为缓解沉香资源紧张问题,有关沉香主要化学成分[11-12]、白木香人工结香技术[13]、白木香组织培养技术[14]等研究相继开展。在本课题组前期研究建立了一个稳定、高效的白木香离体根液体培养体系[15],以组织培养的白木香离体根为材料,建立盐胁迫记忆体系[16-17],探究白木香盐胁迫下的标志性物质,具有繁殖继代快速、生长环境影响因素单一可控等优点。本实验通过对白木香离体根进行多代盐胁迫处理,利用转录组测序分析转录因子家族表达情况,研究白木香TFs表达在连续3代盐胁迫中的变化规律。

1材料

白木香种子采摘自广东省化州市维国沉香种植开发专业合作社,经广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心詹若挺教授鉴定为白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg种子。

2方法

2.1白木香离体根培养

以白木香种子经无菌萌发成苗后、采其苗根组织培养而成的均匀离体根[18]为研究对象。

2.2 3代盐胁迫处理

将离体根于(26±1)℃、110 r/min条件下震荡暗培养,得到生长状态大致均匀的白木香离体侧根,记做第1代,添加含150 mmol/L NaCl的盐胁迫培养基处理3 d,记为N1,空白处理的对照组记为CK1。每组设置8瓶重复,每瓶接种(25±5)条根段。每代胁迫处理后随机选取5瓶取样(取样时先将离体根置于无菌水中洗去杂质,剪去主根,仅保留侧根,无菌吸水纸吸干水分,迅速置于液氮中保持2 min,随即置于?80℃冰箱保存),剩余N1、CK1分别继代培养获得第2、3代,相同处理方法获得N2、CK2及N3、CK3[17]。

2.3 RNA提取和转录组测序

总RNA使用EASYspinPlus植物快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取。用1%琼脂糖凝胶电泳检验RNA完整性,用微量紫外分光光度计测定RNA浓度。测序部分委托广州基迪奥生物科技有限公司完成,样品检验合格后,进行文库构建。

2.4数据组装和功能注释

利用Trinity软件对clean reads做de novo组装,得到Unigene。将拼接得到的Unigene与Nr蛋白数据库、Swiss-prot蛋白数据库、KEGG数据库和COG公共数据库进行BLASTx(E值<1×10?5)比对分析,得到与数据库相一致的Unigene的基因方向和编码区序列。将获得的Unigene在核酸数据库Nt中做本地BLASTTn(E值<1×10?5),获得的同源性最高的蛋白,即为该Unigene的蛋白功能注释结果。

2.5差异表达基因筛选

Unigene的表达丰度采用RPKM(reads per kb million reads)表示,计算公式如下:

RPKM=(C×106)/(N×L×0.001)

RPKM为Unigene标准化后的表达量,C为比对的Unigene的reads数,N为比对到所有Unigene的总reads数,L为Unigene的碱基数

以FDR<0.05且∣log2FC∣>1为条件,筛选出经盐胁迫处理后的白木香离体根和对照组的所有差异表达基因,将每一代各对照组与处理组分为一组进行比较,得到以下3个比对方案:第1代对照组和胁迫组(CK1-VS-N1)、第2代对照组和胁迫组(CK2-VS-N2)、第3代对照组和胁迫组(CK3-VS-N3)的差异表达基因。

2.6转录因子的鉴定分析

将所有白木香Unigene序列与植物转录因子数据库(PlantTFDB)进行比对,鉴定白木香中潜在的转录因子,分析比较3个比对方案中(CK1-VS-N1、CK2-VS-N2、CK3-VS-N3)的差异表达转录因子及其代间变化规律。

3结果与分析

3.1转录组测序与组装

对白木香3代盐胁迫组(N1、N2、N3)和对照组(CK1、CK2、CK3)离体根转录组测序后,使用Trinity软件对无参转录组数据进行拼接,用过滤后的clean reads进行de novo assembly组装,共得到48 286条Unigene,最长Unigene为16 622,最短Unigene为201。所有Unigene序列的N50值为2 165,表明转录组组装完整性较高。所获得的Unigene序列数量随着测序长度的增加呈逐渐减少的趋势(图1),表明测序样品具有较好的测序质量。

3.2差异表达基因分析

以FDR<0.05且∣log2FC∣>1为条件筛选差异表达基因(differentially expressed gene,DEG),在CK1-VS-N1,CK2-VS-N2,CK3-VS-N3中分别筛选出11 422、10 815、11 799条差异基因。通过分析基因变化趋势发现,连续3代的胁迫组与对照组的差异基因中,上调基因数持续减少,而下调的基因数量持续增加(表1),可以看出多代盐胁迫对白木香离体根基因表达趋势的总体影响以下调为主。

3.3白木香转录组数据库中转录因子家族分类

将所有白木香Unigene序列与植物转录因子数据库(PlantTFDB)进行比对,得到54个潜在的白木香TFs家族共1 156个基因(图2)。其中,预测得到的TFs基因数目最多的10个家族分别为bHLH、ERF、NAC、MYB、C2H2、WRKY、MYB_related、bZIP、GRAS和B3家族。对照组CK1、CK2、CK3分别注释到1106、1 115、1 112个TFs,盐胁迫处理组N1、N2、N3分别注释到1 089、1 115、1 114个TFs。

3.4盐胁迫下3代白木香根的差异表达TFs变化规律与比较分析

分析3个比对方案中3代根的差异表达TFs变化规律,第1代白木香离体根经盐胁迫处理后,CK1-VS-N1中有33个TFs家族共290个基因的表达表现出显著性差异,包括109个上调表达,181个下调表达;第2代离体根经盐胁迫处理后,CK2-VS-N2中共有41个TFs家族共277个基因的表达表现出显著性差异,包括98个上调表达,179个下调表达;第3代离体根经盐胁迫处理后,CK3-VS-N3中共有44个TFs家族共349个基因的表达表现出显著性差异,包括142个上调表达,207个下调表达(图3)。CK3-VS-N3中具有差异表达TFs的家族数目最多,差异表达TFs数目同样显著高于CK1-VS-N1和CK2-VS-N2,可以看出连续3代盐胁迫处理使差异表达TFs数量增多。3代白木香的胁迫组与对照组间差异表达TFs的上调表达基因数均少于下调表达的基因数量,表明盐胁迫对白木香TFs表达趋势的影响同样以下调为主。

3.5前10个转录因子家族的3代DEG表达模式分析

选取富集TFs数量最多的10个家族分析其3代差异表达情况,发现3代盐胁迫诱导下的10个白木香TFs家族的DEG表达模式各不相同(图4)。在富集TFs数量最多的bHLH家族中,3代间的差异表达TFs数量和差异表达模式无显著差异;NAC、MYB以及WRKY 3个家族上调表达的DEG数量随胁迫代数增加而增多,而GRAS家族上调表达的DEG数量随胁迫代数增加而减少;B3及MYB_related家族下调表达的DEG数量随胁迫代数增加而增多,C2H2家族下调表达的DEG数量随胁迫代数增加而减少。从不同表达模式的基因数量看,各TFs家族均以下调表达为主。

3.6 3代白木香根的转录因子差异表达基因比较分析

在CK1-VS-N1中,受盐胁迫诱导表达的290个差异表达TFs,有194个在后代(CK2-VS-N2,CK3-VS-N3)中仍保持差异表达,而只在第1代中差异表达的TFs有96个(图5),隶属于29个家族,富集数目最多的前5个家族分别为C2H2、ERF、GRAS、bHLH和NAC(13、9、9、8、7);CK2-VS-N2中,受盐胁迫诱导表达的277个差异表达TFs,有194个在其他代中同样保持差异表达,只在第2代中差异表达的TFs有83个,隶属于27个家族,富集数目最多的前5个家族为MYB,bHLH,bZIP,NAC和ERF(12、8、6、6、5);CK3-VS-N3中,受盐胁迫诱导表达的349个差异表达TFs中,有216个在其他代中同样保持差异表达,只在第3代中差异表达的TFs有133个,隶属于34个家族,富集数目最多的前5个家族为bHLH、WRKY、NAC、MYB和ERF(14、13、12、10、8)。NAC和ERF家族在各代中被特异诱导表达的基因数目均较多,WRKY家族被特异诱导表达的基因数目在前2代较低,在第3代激增(4、2、13)。

3代共有的差异表达转录因子数有70个(图5),分布于22个TFs家族,以ERF、bHLH、B3和MYB(9、8、6、6)4个家族富集数量最多(表2)。70个3代共有差异表达TFs的相对表达量同样以下调为主,在第1代下调表达的基因有50个,第2代下调表达的基因有41个,第3代下调表达的基因有48个;在3代中全部表现出上调表达的基因仅12个,其中WOX家族的基因在3代中均表现为上调表达(表2)。在第1代上调表达log2FC值最高的6个基因在3代中全部表现出上调表达[Unigene0020933(bHLH)、Unigene0015987(C2H2)、Unigene0016607(B3)、Unigene0031459(WOX)、Unigene0040676(ERF)、Unigene0031455(WOX)]。其中Unigene0040676(ERF)上调表达log2FC值第1、2代相近,第3代为第1、2代的4倍,被预测为ERF062-like乙烯响应转录因子。70个基因中被预测为乙烯响应转录因子的共有9个基因,其中8个隶属于ERF家族,1个属于AP2家族。仅在第1代下调表达,第2、3代上调表达的基因有6个[Unigene0038094(ERF)、Unigene0011437(AP2)、Unigene0028105(DBB)、Unigene0020062(WRKY)、Unigene0005341(ERF)、Unigene0020064(WRKY)]。在3代持续下调表达的基因中,Unigene0044600(C2H2)、Unigene0016964(NAC)、Unigene0002712(EIL)、Unigene0036765(ZF-HD)、Unigene0016718(bZIP)、Unigene0010888(MYB)、Unigene0019323(NF-YA)和Unigene0004126(ERF)的下调表达倍数随代数增加而递增,其中Unigene0044600(C2H2)第3代的差异表达倍数是第1代的5倍。

4讨论

植物由于固着的生长模式,在生命过程中不可避免地会遭受各种各样的生物胁迫与非生物胁迫[18]。一些植物在胁迫下可产生胁迫记忆,促使子代能够更主动、高效地应答胁迫,提高对胁迫的抗耐性。随着分子生物信息技术的发展,各组学测序技术被应用于植物胁迫记忆遗传的研究。Ou等[19]对经历3代Hg2+胁迫的水稻进行DNA甲基化模式分析,发现Hg2+胁迫诱导的DNA甲基化修饰模式可以以一定比例稳定遗传给子代,遗传了该甲基化修饰模式的子代对胁迫具有抗耐性。Bilichak等[20]对芜菁Brassica rapavar.trilocularis(Roxb.)Kitam.进行高温胁迫并研究胁迫记忆在子代的传递,推测miR168和braAGO1在植物中参与了胁迫诱导的跨代遗传。李文月[17]研究结果显示,经历连续3代盐胁迫处理的白木香离体根,其胁迫后脯氨酸含量随胁迫代数增加而增高,是具有胁迫记忆现象的表现。

TFs是通过各种信号转导途径调节植物生长发育和适应逆境胁迫的关键信号传递因子。随着生物测序技术飞速发展,各大TFs家族的结构功能框架在拟南芥、花生、棉花、茶树等多种植物中被鉴定与研究,目前已经证实bZIP、bHLH、AP2/ERF、MYB、NAC、WRKY和C2H2等TFs家族成员参与了植物对盐胁迫的应答反应。本研究通过Illumina Hiseq4000双端PE150测序获得盐胁迫3代白木香离体根的转录组数据,数据经过与脯氨酸生物合成相关基因、糖类合成和降解相关基因、色酮类生物合成相关基因及其他目的基因的qRT-PCR实验验证[17],证明了该转录组数据的可靠性。对盐胁迫3代白木香离体根TFs的表达模式进行分析,得到48 286条Unigene序列,包含54个潜在的白木香TFs家族共1 156个基因,预测得到的TFs基因数目最多的10个家族分别为bHLH、ERF、NAC、MYB、C2H2、WRKY、MYB_related、bZIP、GRAS和B3家族。

NAC是植物特有的最大的转录调控因子家族之一,在植物体内具有多重角色,参与干旱和高盐等非生物胁迫响应,能在逆境胁迫下诱导表达,并诱导其他胁迫相关基因的表达,其过表达能明显提高植株抗逆能力。在拟南芥和水稻中,过度表达胁迫应答的NAC(SNAC)基因的转基因植株对胁迫表现出更好的耐旱性[21]。在高盐、干旱、低温胁迫下,紫花苜蓿MsNAC1基因表达量呈现先上调后下调趋势[22]。在本研究中,白木香NAC家族是预测得到的TFs数目最多的前三的家族之一,3代受盐胁迫诱导差异表达基因数为20、22、31,其中上调表达的TFs数量同样呈递增趋势(7、9、16),说明NAC对白木香的盐胁迫应答起到重要调控作用,随着胁迫代数的增加,越来越多的NAC转录因子参与到盐胁迫的响应与调控,李伟等[23]用在线Protparam程序预测NAC蛋白的理化性质,结果显示非生物逆境胁迫相关NAC蛋白主要含有亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸这3种非极性氨基酸。脯氨酸是植物在逆境胁迫下积累的一种有机渗透物质,被认为与植物的抗逆性呈正相关,耐性植株中脯氨酸含量普遍高于胁迫敏感型植株[24]。李文月[17]研究结果表明,白木香离体根中脯氨酸含量随着盐胁迫代数增加而增加,并通过qRT-PCR验证了脯氨酸合成通路中的关键基因P5CSB可作为盐胁迫下白木香根胁迫记忆现象的标志性基因[17],推测NAC家族TFs对白木香脯氨酸的积累及耐盐性具有调控作用。

MYB转录因子通过ABA信号途径参与耐盐抗旱调控,与植物中的其他信号转导途径存在不同程度的交叉[25],在植物生理生化过程中一般起正调控作用,在响应植物逆境胁迫时,MYB基因表达量越高,其抗逆能力也增强[26]。在本研究中,白木香MYB家族也是受盐胁迫诱导差异表达基因数量较多的家族之一,且上调表达的差异表达TFs数量随代数增加而增多(6、7、10),这些上调表达的MYB转录因子对白木香3代抗盐能力的调节起一定的增强作用。WRKY转录因子是在早期防御应答基因的调控中起着重要作用的一个家族,WRKY基因过表达同样能增强植物的抗逆能力,在拟南芥中过表达WRKY25和WRKY33后,其耐盐性和ABA敏感性增强[6]。在本研究中,白木香根盐胁迫后上调表达的WRKY转录因子随胁迫代数增加显著增多(2、6、15),推测在子代显著增多的上调表达TFs积极参加了子代对盐胁迫的抗耐能力的调控与盐胁迫记忆的形成。

在3代白木香根的TFs差异表达基因比较分析中,共有70个3代共有的差异表达基因,其相对表达量同样以下调表达为主,3代中持续上调表达的基因仅12个,其中WOX家族的基因在3代中均表现为上调表达。WOX家族基因在植物胚的形成、干细胞稳定性和器官的形成等发育关键时期发挥重要作用,以促进细胞分裂或阻止未成熟细胞提前分化[27]。WOX基因的表达同样可受非生物胁迫影响,如水稻在干旱胁迫12 h下,几乎所有WOX基因表达水平均有明显的提升,OsWOX3和OsWOX5基因在盐胁迫下被诱导表达[28]。在3代盐胁迫中均上调表达的2个基因注释为WOX1,其表达部位在侧生器官原基[29],推测其参与器官横向发育以抵抗白木香根的盐胁迫。第1代上调表达log2FC值最高的前6个基因在3代中全部表现出上调表达。ERF家族的Unigene0040676上调表达log2FC值在第1、2代相近,到第3代增至为第1、2代的4倍,说明通过连续3代胁迫触发了该基因更高的表达。ERF家族也是植物在抗逆调控方面有重要作用的TFs家族之一,通过多方面的转录调控参与植物的生长和抗逆性。在茶树Camellia sinensis L.中,高温胁迫使Cs047-ERF-B3基因表达量持续升高[29]。在白木香根转录组中共预测得到90个ERF家族成员,是富集TFs数量排名第2的家族。

在3代持续下调表达的基因中,有8个基因[Unigene0044600(C2H2),Unigene0016964(NAC),Unigene0002712(EIL),Unigene0036765(ZF-HD),Unigene0016718(bZIP),Unigene0010888(MYB),Unigene0019323(NF-YA)和Unigene0004126(ERF)]的下调表达倍数随代数增加而递增,暗示了多代胁迫对部分基因表达的调控作用有叠加效应,其中Unigene0044600(C2H2)第3代的差异表达倍数是第1代的5倍,推测这些基因参与了白木香盐胁迫的应答与胁迫记忆的传递。有6个基因[Unigene0038094(ERF)、Unigene0011437(AP2)、Unigene0028105(DBB)、Unigene0020062(WRKY)、Unigene0005341(ERF)、Unigene0020064(WRKY)]仅在第1代下调表达,第2、3代上调表达,说明多代胁迫对部分基因的调控作用不同于单代胁迫,其在子代对胁迫的响应与亲代产生差别,这些基因可能参与了对盐胁迫的应答,但是否参与植物盐胁迫记忆的传递,其他TFs家族是否也存在参与胁迫记忆传递的相关基因,以及这些基因是通过什么信号转导途径起作用的,有待进一步研究。

转录因子调控植物分子抗逆及胁迫记忆机制是一个极其复杂的动态网络。此研究有利于帮助了解白木香转录因子应答盐胁迫的表达情况变化,加深白木香面对胁迫应答机制的认识。

参考文献(略)

来源:方泽蘅,李文月,马新业,詹若挺.盐胁迫下的3代白木香离体根的转录因子表达分析[J].中草药,2019,50(10):2442-2451.

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